Page 89 - Učilnica za življenje

Z medinstitucionalnim povezovanjem vzgajamo proaktivne posameznike

S projektno nalogo smo poskušali ugotoviti, kakšen vpliv imajo te ponovitve
na toksičnost v celici, ki lahko pripelje do avtofagije ali apoptoze, zaključi pa
se s celično smrtjo, ter ali imajo katere izmed ponovitev na delovanje večji
vpliv kot druge.
Za pridobitev rezultatov smo uporabljali različne celične metode, trans-
fekcijo in lizo HEK-293-celic, in biokemijske metode – merjenje koncentracije
proteinov, poliakrilamidno gelsko elektroforezo, prenos po Westernu ter de-
tekcijo vzorčnih proteinov z napravo za fluorescentno in kemoiluminiscen-
tno analizo. S pomočjo opisanih tehnik smo testirali postavljene hipoteze o
vplivu dipeptidnih ponovitev C9orf72-gena na procese apoptoze in avtofa-
gije v celicah. Zaradi dela na biološkem sistemu smo za verodostojnost rezul-
tatov naredili tri biološke ponovitve vsakega eksperimenta.
Začeli smo z gojenjem trajne celične linije HEK-293 (človeške embrionalne
ledvične celice). Celice so v osnovi rakave, kar jim daje sposobnost hitre de-
litve ter s tem omogoča neomejeno rast v gojišču. Celice za rast potrebujejo
hranilni medij, dodajali smo jim DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium),
medij z visoko vsebnostjo glukoze. Celice rastejo pritrjene na površino. Za
medij je značilna sprememba barve iz rdeče v rumeno; ko mu zmanjka hranil-
nih snovi in se mu zaradi izrabljenosti spremeni pH-vrednost, takrat je treba
zamenjati gojišče. Pri menjavi gojišča ploščo s celicami rahlo nagnemo in s
stekleno Pasteurjevo pipeto izsesamo izrabljeno gojišče, potem ga zame-
njamo s primerno količino svežega gojišča in celice znova inkubiramo pri
37°C in 5-odstotnem CO 2 . Pri vseh celičnih metodah je pomembna sterilnost,
zato vse postopke izvajamo v brezprašni komori.
Po določeni inkubacijski dobi smo celice vzeli iz inkubatorja in jih opazo-
vali s fluorescentnim mikroskopom. Ker so bili vsi naši proteini z dipeptidnimi
ponovitvami, katerih DNK-zapis smo dali v celice, fluorescentno označeni,
smo lahko spremljali uspešnost transfekcije poliGA-, poliGR-, poliGP-, poliPA-
, poliPR-vzorcev ter kontrole le-teh (tu smo celice transfecirali samo z zelenim
fluorescirajočim proteinom). Preverili smo izražanje proteinov in njihovo lo-
kalizacijovcelicah.Dabipotrdilipravilnolokacijoproteinovvcelicah,jetreba
vedeti, kje se tipično nahajajo:

– K – transfecirali smo samo zeleni fluorescentni protein (GFP), ki se izraža
disperzno po celotni celici;
– GA-protein je agregiran v citoplazmi celic in je toksičen, zato spremeni
obliko celic, ki ga proizvajajo;
– GR-protein se nahaja v velikih agregatih v citoplazmi ali pa disperzno v
citoplazmi;

89