Page 90 - Učilnica za življenje

Darja Rizmal

– PR-agregiran protein se nahaja v jedrcih znotraj jedra;
– GP-protein se nahaja disperzno po celotni celici;
– PA-protein se nahaja povsod v celični citoplazmi, ni pa prisoten v jedru.

Kljub začetnemu prepričanju, da bodo ponovitve GA, GR in PR najbolj to-
ksične ter da bo ta citotoksičnost sprožila apoptozo kot posledico agregatov
teh proteinov zaradi lastnosti proteinov, smo hipotezo glede na zbrane re-
zultate ovrgli. Pri proteinu PARP1 namreč nismo zaznali cepljene oblike niti
pri ponovitvah GA, GR in PR niti pri ostalih ponovitvah. Pri proteinu LC3 smo
zaznali nekoliko višje razmerje med cepljeno in necepljeno obliko pri vseh
vzorcih, vendar je razlika signifikantna le pri GA-vzorcu. Tako lahko sklepamo,
da le poliGA vpliva na povečanje avtofagije. Zanimala nas je predvsem avto-
fagija kot posledica napačnega zvijanja in agregacije proteinov, saj je znano,
da nekateri DPR-proteini povzročijo nastajanje agregatov. Predvidevali smo,
da bodo DPR-proteini, ki agregirajo (GA, GR, PR), bolj toksični za celice oz.
bodo bolj sprožili delovanje avtofagije, saj bi celica s pomočjo avtofagije že-
lela te agregate razgraditi. PoliGA naredi morfološko največje skupke (agre-
gate), kar smo na mikroskopskih slikah pokazali tudi mi, poleg tega smo pod
vidno svetlobo opazili več celic, ki so izgubile svojo morfološko obliko in po-
stale okrogle. Obe spremembi kažeta na to, da se v celicah nekaj dogaja. Av-
tofagijo smo spremljali s pomočjo prenosa po Westernu in imunodetekcije
proteina LC3, ki je značilen pokazatelj avtofagije. Pri proteinu LC3 pa smo do-
ločali razmerje med necepljeno (LC3I) in cepljeno (LC3II) obliko. Če se to raz-
merje poviša, pomeni, da je več cepljene oblike LC3, kar kaže na to, da so v
celici povečani procesi avtofagije. Po izračunu razmerja med LC3I in LC3II, ki
smo ga dobili iz intenzitet lis na membrani, smo pokazali, da poliGA-protein
v primerjavi s kontrolo raven avtofagije poviša za enkrat. Prav tako smo za-
znali rahlo povišanje avtofagije pri ostalih DPR-proteinih, vendar je bilo to
povečanje le nekajodstotno.
Glede na literaturo smo takšne rezultate tudi pričakovali, saj GA tvori naj-
večje agregate, ki se jih celica želi čim prej znebiti. Večjo spremembo smo
pričakovali tudi pri vzorcih GR in PR, saj tudi ta dva proteina tvorita agregate,
vendar pomembnejšega povišanja pri njiju nismo zaznali. Pri proteinu PARP1
smo pričakovali, da bomo videli njegovo cepljeno obliko, ki je prisotna pri
celicah, v katerih se dogaja proces apoptoze. Cepljene oblike pri vzorcih ni-
smo zaznali, zato lahko trdimo, da izražanje DPR-jev ne povzroča apoptoze.
Eno od cepljenih oblik PARP1 smo zaznali pri GP-vzorcu, vendar smo to pro-
teinsko liso prav tako zaznali po nanosu protiteles proti GP (proteinska lisa za
125 ponovitev GP namreč ustreza enaki velikosti, kot smo jo zaznali), kar nam

90